（原作於 2013 年 8 月 18 日）這篇文章要介紹的是一個五年前還很冷門的東西，它這幾年來名氣逐漸成長，做微生物學的多半都聽過，今年突然大暴紅，成為尖端生物科技的結晶代表，各個生物領域多半都有耳聞－它就是CRISPR。
CRISPR是縮寫，全名叫作“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”，好了，你不會再看到全名了，因為這個全名我也背不起來。
很幸運的，我是在CRISPR今年大爆紅以前就知道它，並做過一點小小的論文搜尋。這個感覺就好像某天有位無名小模讓你驚鴻一瞥，然後隔年大家都知道她叫林志玲一樣，有種……跟她一起成長的感覺？
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我第一次看到CRISPR，是去年中在一本講演化發明的書上。因為這東西乍看之下很神奇，我就去找了一些論文來看，它的神奇之處在於，CRISPR是一種“原核生物的後天免疫系統”（Marraffini and Sontheimer., Nature Review Genetics, 2010）！什麼是“原核生物”？就是細菌和“太古生物（也叫古生菌、英文archaea）”；什麼是“後天免疫（adaptive immunity）”？最知名的，就是人類用抗體來抵抗疾病的那套免疫。天啊，細菌竟然也有後天免疫，這真是太神奇了。
CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea
為什麼細菌需要免疫系統？細菌固然很多時候作為病原的角色，會感染其他生物，但細菌和人類一樣，也會受到病毒與某些遺傳物質（例如plasmid 質體）感染，這時細菌就成了宿主，假如不能有效抵抗感染，細菌也會被病毒殺死，因此細菌演化出一些免疫系統，讓自己活的更健康快樂，是很正常的事，例如很多分子生物學實驗用到的“限制酵素（restriction enzyme）”，最早就是從細菌的免疫系統拿來，人工改良後使用的。
比較早的研究，認為大約有40%的細菌物種帶有CRISPR系統，而太古生物（內行人應該看到這個名詞，就知道我是哪個系統養出來的）則高達90%（Sorek et al., Nature Review Microbiology, 2008），不少論文就一直引用這個數據，然而這5年來DNA定序的技術突飛猛進，被定序的細菌也愈來愈多。
最近我聽了一個演講，講者是做原核生物重覆序列（repeat sequence）的專家，CRISPR正是一種重覆序列，所以他也有不少親身研究，他的說法是，太古生物是90%沒錯，但帶有CRISPR的細菌，可能介於60到70%左右，比本來的估計更高。
一方面當然是因為五年來數據的累積，另一方面我想是來自，現在電腦程式在判斷DNA序列上，比以前更高明，所以可以找到以前沒認出來的CRISPR序列（這是定序難搞的地方，它有處理生物的前半部份，以及處理程式的後半部份，所幸兩邊科技都在持續突飛猛進）。
這麼多原核生物配備的CRISPR系統，如前所述，是一套執行後天免疫的系統，而它之所以是“後天免疫”，是由於它可以“記憶”“專一”的病原，想想看人類主要的後天免疫機制是什麼？你這次被A病毒感染，你的免疫細胞就會記住A病毒的長相，然後產生專門對抗它的抗體，這樣下次再跟A病毒見面，你就有針對它的抗體可以宰了它，但專殺A病毒的抗體，不能也殺B病毒（當 然這是極度簡化的版本）。這裡最關鍵的能力就是“記憶”和“專一”，因此廣義來說，只要能記憶專一病原的生物機制，都可以算是“後天免疫”，而 CRISPR就符合這個定義，這也就是，為什麼CRISPR的作用機制和人等脊椎動物這麼不一樣，卻仍然被當成後天免疫的原因。
後天免疫系統如何執行它們的功能？脊椎動物是靠抗體，原核生物的CRISPR則是利用RNA。要知道CRISPR的作用，首先要知道它的基因結構，如下圖（Wiedenheft et al., Nature, 2012）：
RNA-guided genetic silencing systems in bacteria
在原核生物的基因組中，CRISPR是一串很長的DNA序列，基本上，最5端（開頭）有一串cas基因，也叫“cas casette”，“cas”是“CRISPR associated”的縮寫，這些基因顧名思義，做出來的蛋白質和CRISPR系統運作有關，而每個cas基因，依據發現時間與後來的整理，命名為cas1、cas2、cas3……依此類推。
cas casette的最後，會接上一段幾百DNA長的“leader”序列，leader有後面CRISPR loci的promoter功能，然而熟悉分子生物學的人都知道，promoter不需要長到幾百bp（base pair，DNA是雙股，核苷酸是一對），所以這麼長的leader，除了作為promoter功能之外的其餘部份，究竟是何功用，仍然很不清楚。
Leader序列結束後，是CRISPR的重覆序列，由兩個單元組成，前面叫“repeat（R）”，後面是“spacer（S）”，就這樣一個R接一個S，用RS的型式一直重覆下去，每個RS組合裡，R都是一模一樣的，S則來自“從病原身上抓回來的序列”，而repeat與spacer的長度，則是因不同原核生物種類，以及不同CRISPR的型號而異。RS組合的數目，已知最高可以多達四位數，因此一整套CRISPR系統，長度可以非常非常長；另一重點是，CRISPR有明顯的“起頭”（cas casette和leader），卻沒有很明顯的“結尾”，至少目前我們對CRISPR的結尾所知仍十分有限，這個性質和普通基因很不一樣。
由cas基因的不同與演化差異，與CRISPR的結構組成，現在微生物學家把眾多的CRISPR系統分為三型，名字就叫type I、II和III，每個型號都有一些共通的特性。第一型CRISPR結構比較複雜，通通配有cas3這個基因，cas3的產物是個酵素，同時擁有“nuclease（切斷DNA）”和“helicase（把雙股DNA打開成單股）”的功能。
第二型CRISPR相對簡單，所有第二型都配備cas9這 個基因（別小看它！它現在當紅的程度，就像當年的林志玲），它的產物酵素同時擁有“RNA processing（把RNA搞成正確的作用形式）”和“target destruction（摧毀病原）”兩個功能。正是因為它具有如此方便又強大的威力，才讓聰明的科學家想到，可以利用這些特性，把一個本來是細菌免疫系統的東西，改良成拿來基因改造的生物科技。
第三型 CRIPSPR比較特殊，又分A和B兩個次型。三A的目標是質體DNA，這個不特殊，然而三B就和別人不一樣，在in vitro（非生物體內）的狀況下，三B的目標是“單股RNA”，這和其他所有CRISPR系統，都辨識DNA為目標的狀況截然不同，這意味三B平時的作用，可能是專門對付RNA病毒；另一個可能是，三B系統專門挑病毒轉錄出RNA時下手。
所有CRISPR系統，不論一二三型，都有cas1這個基因，這暗示cas1可能有一些很基本，不可或缺的功能（意思就是仍有待研究）。另外同一隻細菌裡，不見得只有一套CRISPR，某些細菌可能同時配有兩款以上的CRISPR軍火庫，這個現象暗示，不同型號的CRISPR系統之間，某些元件可能可以互通有無，這是未來值得探討的問題。
CRISPR的功能是執行後天免疫，摧毀再次入侵的病原，具體的步驟可分為三步：首先是把首次入侵的病原，上面的DNA抓一段下來，擺進自己的序列；然後下次見面時，再把這段來自病原的序列表現出RNA；最後透過各種機制，讓這段RNA去辨識目標，精準打擊，有效摧毀。
第一步，細菌如何把入侵病毒的序列抓來，又是如何決定要抓哪一段，這些過程仍有許多未知之處。確定的事實是，新捕獲的序列（也就是新的spacer），會從CRISPR的 “開頭”這端加起，就是最接近leader的地方，這個機制的好處是，愈新碰過的敵人資訊，會被擺在愈前面，也就能愈早被表現，畢竟最近碰過的，短期內再碰到的機率比較大，然後很久沒再遇到的，就會被愈洗愈後面（CRISPR的結尾問題應該還是問題）。
目前一些證據顯示， 有段叫PAM（protospacer adjacent motif）的短序列，對細菌決定捕回哪段病毒的DNA有重要的影響。不同種細菌有自己特殊的PAM序列，它們會辨識病毒DNA上有沒有一樣的序列，然後 切下PAM旁邊的DNA，作為自己未來的spacer用。除此之外，也有人認為，cas1既然存在所有CRISPR系統，而所有CRISPR系統都需要新增spacer，也許cas1在新增spacer時會有某些功能，不過這方面仍多屬未知。
免疫系統不可避免的 問題是，要如何“分辨敵我”？非我即敵，才需要免疫系統攻打討伐，但假如免疫系統不辨敵我，一起亂打，會是足以致死的嚴重問題。CRISPR系統的“我” 就是細菌自己，取自病原的spacer序列，而“敵”自然是病毒上的一樣序列，然而CRISPR系統分辨敵我的手段，目前仍不非常清楚，一個假說是，細菌自己的spacer旁邊連著repeat序列，但病原沒有，不過此說仍待證明。
在獲得新病原的序列後，下次再見面，CRISPR就可以把這段spacer表現出來，經過修飾以後，再利用它的專一性，去精準打擊目標。三個型號的CRISPR系統各有自己的作法，利用不同的cas和機制做這些事，細節這裡就不多講。而摧毀病原目標上，牽涉蛋白質與DNA的空間結構（體位很重要的），相關cas蛋白質結構的形狀，三個型號都已經被解出來，不過這個太專業了，就此打住。
以上就是 CRISPR的簡介，在驚豔的初遇之後，因為我不是作微生物的，所以有一段時間沒特別注意CRISPR的消息。我第二次聽到CRISPR，是去年12月， 哈佛大學的Scott Edwards教授來演講，那次的題目是一種鳥（house finch）與牠的細菌病原體（mycoplasma）間共同演化的關係，他講到一半秀出一張圖，他還沒講，我就注意到CRISPR（印象深刻啊），果然 CRIPSPR正是那張圖，以及他這個研究的關鍵重點（Delaney et al., PLoS Genetics, 2012）。
這個研究指出，感染鳥類的細菌其CRISPR演化，可以非常的快，短短時間就能丟掉一整段CRISPR。我覺得這個研究最有意思的在於，鳥是細菌的宿主，細菌是鳥的病原，然而不同地方的鳥，體內細菌帶有的CRISPR卻差很大，CRISPR又跟細菌抵抗病毒有關，也就是說，此時細菌是宿主，病毒是病原。這裡，細菌既是宿主，又是病原，鳥、細菌和病毒三者的關係，非常值得玩味。
聽過這個微生物研究提到CRISPR之後，下次再見到CRISPR，它已經光芒萬丈，成為今年生物領域最紅的新星之一了，這段是另一個故事，沒辦法擠在這裡用幾句話講清楚。CRISPR的改造與應用有多重要？它有潛力改變這個世界！
CRISPR除了免疫的功能之外，有沒有其他作用？其實看看那排精美的cas casette，都是一些很好用的蛋白質，有研究猜測，CRISPR除了免疫之外，可能也參與某些細菌的基因調控，不過現在要下結論仍嫌太早。比較確定的是，在某種細菌上，CRISPR會影響這個細菌的致病力（Sampson et al., Nature, 2013），這個今年5月發表的研究，讓我們對CRISPR可能能做的事，提供了很有意思的想像空間。
A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence
隨堂複習，這是哪種型號的CRISPR？
更有想像空間的是，原核生物的CRISPR系統，本來主要是為了對抗病毒而存在的，但某些本該是CRISPR受害者的病毒，竟然有樣學樣，在身上也裝備了CRISPR！這些病毒配備的CRISPR，可以使病毒成功擊敗細菌的某套先天免疫系統（CRISPR是細菌的後天免疫，但除此之外，細菌還有好幾套別的先天免疫戰術），讓病毒成功感染細菌（Seed et al., Nature, 2013），這個今年2月發表的研究，使CRISPR能做的事情，跨出了原核生物的範圍，只能說，CRISPR實在太神奇了！
A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity
大部分原核生物都擁有CRISPR系統，主要是執行後天免疫的功能，但它的作用機制又使它可能參與基因表現的調控，也已經證實，CRISPR會影響細菌的致病力，另外它的演化速度可以極快，甚至連病毒都可以配備並使用CRISPR，以上各方面都有值得繼續深入研究追蹤的價值。而利用改造的CRISPR系統，去做基因改造的工作，是非常有潛力的一項生物科技，這也是它短短時間暴紅的主因，有關這點，就是另一個一樣精彩的故事了。
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原作於：CRISPR：原核生物的後天免疫系統與其他（2013年8月18日）
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