轉載自:CRISPR:原核生物的後天免疫系統與其他(2013年8月18日)

這篇文章要介紹的是一個五年前還很冷門的東西,它這幾年來名氣逐漸成長,做微生物學的多半都聽過,今年突然大暴紅,成為尖端生物科技的結晶代表,各個生物領域多半都有耳聞-它就是CRISPR。

林志玲大學  via 這裡

 

CRISPR是縮寫,全名叫作“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”,好了,你不會再看到全名了,因為這個全名我也背不起來。

 

很幸運的,我是在CRISPR今年大爆紅以前就知道它,並做過一點小小的論文搜尋。這個感覺就好像某天有位無名小模讓你驚鴻一瞥,然後隔年大家都知道她叫林志玲一樣,有種……跟她一起成長的感覺?

 

我第一次看到CRISPR,是去年中在一本講演化發明的書上。因為這東西乍看之下很神奇,我就去找了一些論文來看,它的神奇之處在於,CRISPR是一種“原核生物的後天免疫系統”(Marraffini and Sontheimer., Nature Review Genetics, 2010)!什麼是“原核生物”?就是細菌和“太古生物(也叫古生菌、英文archaea)”;什麼是“後天免疫(adaptive immunity)”?最知名的就是人類用抗體來抵抗疾病的那套免疫。天啊,細菌竟然也有後天免疫,這真是太神奇了。

CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea

 

CRISPR serve as the adaptive immunity in prokaryotes 

 

為什麼細菌需要免疫系統?細菌固然很多時候作為病原的角色,會感染其他生物,但細菌和人類一樣,也會受到病毒與某些遺傳物質(例如plasmid 質體)感染,這時細菌就成了宿主,假如不能有效抵抗感染,細菌也會被病毒殺死,因此細菌演化出一些免疫系統,讓自己活的更健康快樂,是很正常的事,例如很多分子生物學實驗用到的“限制酵素(restriction enzyme)”,最早就是從細菌的免疫系統拿來,人工改良後使用的。

 

比較早的研究,認為大約有40%的細菌物種帶有CRISPR系統,而太古生物(內行人應該看到這個名詞,就知道我是哪個系統養出來的)則高達90%(Sorek et al., Nature Review Microbiology, 2008),不少論文就一直引用這個數據,然而這5年來DNA定序的技術突飛猛進,被定序的細菌也愈來愈多。

CRISPR — a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea

 

最近我聽了一個演講,講者是做原核生物重覆序列(repeat sequence)的專家,CRISPR正是一種重覆序列,所以他也有不少親身研究,他的說法是,太古生物是90%沒錯,但帶有CRISPR的細菌,可能介於60到70%左右,比本來的估計更高。

 

一方面當然是因為五年來數據的累積,另一方面我想是來自,現在電腦程式在判斷DNA序列上,比以前更高明,所以可以找到以前沒認出來的CRISPR序列(這是定序難搞的地方,它有處理生物的前半部份,以及處理程式的後半部份,所幸兩邊科技都在持續突飛猛進)。

 

這麼多原核生物配備的CRISPR系統,如前所述,是一套執行後天免疫的系統,而它之所以是“後天免疫”,是由於它可以“記憶”“專一”的病原,想想看人類主要的後天免疫機制是什麼?你這次被A病毒感染,你的免疫細胞就會記住A病毒的長相,然後產生專門對抗它的抗體,這樣下次再跟A病毒見面,你就有針對它的抗體可以宰了它,但專殺A病毒的抗體不能也殺B病毒(當 然這是極度簡化的版本)。這裡最關鍵的能力就是“記憶”和“專一”,因此廣義來說,只要能記憶專一病原的生物機制,都可以算是“後天免疫”,而 CRISPR就符合這個定義,這也就是,為什麼CRISPR的作用機制和人等脊椎動物這麼不一樣,卻仍然被當成後天免疫的原因。

 

後天免疫系統如何執行它們的功能?脊椎動物是靠抗體,原核生物的CRISPR則是利用RNA。要知道CRISPR的作用,首先要知道它的基因結構,如下圖(Wiedenheft et al., Nature, 2012):

RNA-guided genetic silencing systems in bacteria

 

CRISPR loci  

 

在原核生物的基因組中,CRISPR是一串很長的DNA序列,基本上,最5端(開頭)有一串cas基因,也叫“cas casette”,“cas”是“CRISPR associated”的縮寫,這些基因顧名思義,做出來的蛋白質和CRISPR系統運作有關,而每個cas基因,依據發現時間與後來的整理,命名為cas1cas2cas3……依此類推。

 

cas casette的最後,會接上一段幾百DNA長的“leader”序列,leader有後面CRISPR loci的promoter功能,然而熟悉分子生物學的人都知道,promoter不需要長到幾百bp(base pair,DNA是雙股,核苷酸是一對),所以這麼長的leader,除了作為promoter功能之外的其餘部份,究竟是何功用,仍然很不清楚。

 

Leader序列結束後,是CRISPR的重覆序列,由兩個單元組成,前面叫“repeat(R)”,後面是“spacer(S)”,就這樣一個R接一個S,用RS的型式一直重覆下去,每個RS組合裡,R都是一模一樣的,S則來自“從病原身上抓回來的序列”,而repeat與spacer的長度,則是因不同原核生物種類,以及不同CRISPR的型號而異。RS組合的數目,已知最高可以多達四位數,因此一整套CRISPR系統,長度可以非常非常長;另一重點是,CRISPR有明顯的“起頭”(cas casette和leader),卻沒有很明顯的“結尾”,至少目前我們對CRISPR的結尾所知仍十分有限,這個性質和普通基因很不一樣。

 

cas基因的不同與演化差異,與CRISPR的結構組成,現在微生物學家把眾多的CRISPR系統分為三型,名字就叫type I、II和III,每個型號都有一些共通的特性。第一型CRISPR結構比較複雜,通通配有cas3這個基因,cas3的產物是個酵素,同時擁有“nuclease(切斷DNA)”和“helicase(把雙股DNA打開成單股)”的功能。

 

第二型CRISPR相對簡單,所有第二型都配備cas9這 個基因(別小看它!它現在當紅的程度,就像當年的林志玲),它的產物酵素同時擁有“RNA processing(把RNA搞成正確的作用形式)”和“target destruction(摧毀病原)”兩個功能。正是因為它具有如此方便又強大的威力,才讓聰明的科學家想到,可以利用這些特性,把一個本來是細菌免疫系統的東西,改良成拿來基因改造的生物科技。

 

第三型 CRIPSPR比較特殊,又分A和B兩個次型。三A的目標是質體DNA,這個不特殊,然而三B就和別人不一樣,在in vitro(非生物體內)的狀況下,三B的目標是“單股RNA”,這和其他所有CRISPR系統,都辨識DNA為目標的狀況截然不同,這意味三B平時的作用,可能是專門對付RNA病毒;另一個可能是,三B系統專門挑病毒轉錄出RNA時下手。

 

所有CRISPR系統,不論一二三型,都有cas1這個基因,這暗示cas1可能有一些很基本,不可或缺的功能(意思就是仍有待研究)。另外同一隻細菌裡,不見得只有一套CRISPR,某些細菌可能同時配有兩款以上的CRISPR軍火庫,這個現象暗示,不同型號的CRISPR系統之間,某些元件可能可以互通有無,這是未來值得探討的問題。

 

CRISPR的功能是執行後天免疫,摧毀再次入侵的病原,具體的步驟可分為三步:首先是把首次入侵的病原,上面的DNA抓一段下來,擺進自己的序列;然後下次見面時,再把這段來自病原的序列表現出RNA;最後透過各種機制,讓這段RNA去辨識目標,精準打擊,有效摧毀。

 

第一步,細菌如何把入侵病毒的序列抓來,又是如何決定要抓哪一段,這些過程仍有許多未知之處。確定的事實是,新捕獲的序列(也就是新的spacer),會從CRISPR的 “開頭”這端加起,就是最接近leader的地方,這個機制的好處是,愈新碰過的敵人資訊,會被擺在愈前面,也就能愈早被表現,畢竟最近碰過的,短期內再碰到的機率比較大,然後很久沒再遇到的,就會被愈洗愈後面(CRISPR的結尾問題應該還是問題)。

 

CRISPR novel spacer acquistion  

 

目前一些證據顯示, 有段叫PAM(protospacer adjacent motif)的短序列,對細菌決定捕回哪段病毒的DNA有重要的影響。不同種細菌有自己特殊的PAM序列,它們會辨識病毒DNA上有沒有一樣的序列,然後 切下PAM旁邊的DNA,作為自己未來的spacer用。除此之外,也有人認為,cas1既然存在所有CRISPR系統,而所有CRISPR系統都需要新增spacer,也許cas1在新增spacer時會有某些功能,不過這方面仍多屬未知。

 

免疫系統不可避免的 問題是,要如何“分辨敵我”?非我即敵,才需要免疫系統攻打討伐,但假如免疫系統不辨敵我,一起亂打,會是足以致死的嚴重問題。CRISPR系統的“我” 就是細菌自己,取自病原的spacer序列,而“敵”自然是病毒上的一樣序列,然而CRISPR系統分辨敵我的手段,目前仍不非常清楚,一個假說是,細菌自己的spacer旁邊連著repeat序列,但病原沒有,不過此說仍待證明。

 

在獲得新病原的序列後,下次再見面,CRISPR就可以把這段spacer表現出來,經過修飾以後,再利用它的專一性,去精準打擊目標。三個型號的CRISPR系統各有自己的作法,利用不同的cas和機制做這些事,細節這裡就不多講。而摧毀病原目標上,牽涉蛋白質與DNA的空間結構(體位很重要的),相關cas蛋白質結構的形狀,三個型號都已經被解出來,不過這個太專業了,就此打住。

 

CRISPR biogenesis  

 

以上就是 CRISPR的簡介,在驚豔的初遇之後,因為我不是作微生物的,所以有一段時間沒特別注意CRISPR的消息。我第二次聽到CRISPR,是去年12月, 哈佛大學的Scott Edwards教授來演講,那次的題目是一種鳥(house finch)與牠的細菌病原體(mycoplasma)間共同演化的關係,他講到一半秀出一張圖,他還沒講,我就注意到CRISPR(印象深刻啊),果然 CRIPSPR正是那張圖,以及他這個研究的關鍵重點(Delaney et al., PLoS Genetics, 2012)。

Ultrafast Evolution and Loss of CRISPRs Following a Host Shift in a Novel Wildlife Pathogen, Mycoplasma gallisepticum

 

CRISPR evolution in Mycoplasm

 

這個研究指出,感染鳥類的細菌其CRISPR演化,可以非常的快,短短時間就能丟掉一整段CRISPR。我覺得這個研究最有意思的在於,鳥是細菌的宿主,細菌是鳥的病原,然而不同地方的鳥,體內細菌帶有的CRISPR卻差很大,CRISPR又跟細菌抵抗病毒有關,也就是說,此時細菌是宿主,病毒是病原。這裡,細菌既是宿主,又是病原,鳥、細菌和病毒三者的關係,非常值得玩味。

 

聽過這個微生物研究提到CRISPR之後,下次再見到CRISPR,它已經光芒萬丈,成為今年生物領域最紅的新星之一了,這段是另一個故事,沒辦法擠在這裡用幾句話講清楚。CRISPR的改造與應用有多重要?它有潛力改變這個世界!

 

CRISPR除了免疫的功能之外,有沒有其他作用?其實看看那排精美的cas casette,都是一些很好用的蛋白質,有研究猜測,CRISPR除了免疫之外,可能也參與某些細菌的基因調控,不過現在要下結論仍嫌太早。比較確定的是,在某種細菌上,CRISPR會影響這個細菌的致病力(Sampson et al., Nature, 2013),這個今年5月發表的研究,讓我們對CRISPR可能能做的事,提供了很有意思的想像空間。

A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence

 

CRISPR contributed to  evasion and virulence  

 

隨堂複習,這是哪種型號的CRISPR?

 

更有想像空間的是,原核生物的CRISPR系統,本來主要是為了對抗病毒而存在的,但某些本該是CRISPR受害者的病毒,竟然有樣學樣,在身上也裝備了CRISPR!這些病毒配備的CRISPR,可以使病毒成功擊敗細菌的某套先天免疫系統(CRISPR是細菌的後天免疫,但除此之外,細菌還有好幾套別的先天免疫戰術),讓病毒成功感染細菌(Seed et al., Nature, 2013),這個今年2月發表的研究,使CRISPR能做的事情,跨出了原核生物的範圍,只能說,CRISPR實在太神奇了!

A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity

 

大部分原核生物都擁有CRISPR系統,主要是執行後天免疫的功能,但它的作用機制又使它可能參與基因表現的調控,也已經證實,CRISPR會影響細菌的致病力,另外它的演化速度可以極快,甚至連病毒都可以配備並使用CRISPR,以上各方面都有值得繼續深入研究追蹤的價值。而利用改造的CRISPR系統,去做基因改造的工作,是非常有潛力的一項生物科技,這也是它短短時間暴紅的主因,有關這點,就是另一個一樣精彩的故事了。

 

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